Teknologi Penyuntingan Gen CRISPR dan Teknik Terbaharu Pengesanan COVID-19

Oleh : Dr Mohamad Aimanuddin Mohtar1, Dr Saiful Effendi Syafruddin1
Prof Madya Ts Dr Amir Syahir Bin Amir Hamzah2

1 Institut Perubatan Molekul UKM (UMBI), Jalan Yaakob Latiff, Bandar Tun Razak, 56000 Cheras, Wilayah Persekutuan Kuala Lumpur.

2 Jabatan Biokimia, Fakulti Bioteknologi dan Sains Biomolekul, Universiti Putra Malaysia, 43400 UPM Serdang, Selangor

Pengenalan: Apakah itu CRISPR dan pengeditan gen/genom?

Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) adalah sistem imun adaptif yang digunakan oleh bakteria sebagai pertahanan daripada serangan virus (Lander, 2016). Bakteria seringkali mendapat serangan daripada virus. Apabila virus menyerang, bakteria akan merembeskan enzim untuk memotong dan mengusir virus ini. Dalam masa yang sama, bakteria ini akan juga mengintegrasi sebahagian kod genetik virus ini ke dalam genomnya sendiri. Sekiranya virus ini menyerang untuk kali kedua, sebahagian genom virus yang disimpan akan ditranskripsikan untuk menghasilkan molekul RNA. Molekul RNA virus ini kemudiannya akan digunakan oleh bakteria untuk mengenalpasti genom virus tersebut dan seterusnya mengikat serta mengusir virus berkenaan daripada bakteria.

Enzim yang bertanggungjawab untuk mengikat genom virus itu dikenali sebagai protein Cas. Terdapat banyak protein Cas yang telah dijumpai, namun demikian protein Cas9 adalah yang terawal ditemui dan dicirikan secara komprehensif, serta sering diguna pakai dalam bidang penyelidikan berkaitan CRISPR (Adli, 2018). Satu kompleks khusus akan dibentuk oleh molekul RNA virus yang telah ditranskripsikan oleh bakteria dan protein Cas (CRISPR/Cas kompleks). Kompleks ini seterusnya yang akan mengikat genom berdasarkan pelengkap Watson-Crick (Watson-Crick base pairing) (Rajah 1). Dengan menggunakan komponen ini, sistem CRISPR/Cas dapat mengaktifkan imuniti adaptif (imunisasi dan pertahanan) daripada serangan virus.

Para penyelidik kemudiannya mendapati bahawa jika kita dapat merekabentuk RNA (sebagai panduan) yang melengkapi hos DNA (target), protein Cas akan pergi ke sasaran hos DNA ini dan dapat “mematikan” hos DNA tersebut. Dalam erti kata lain, jika kita dapat memberi isyarat kepada sistem CRISPR-Cas tentang apa yang ia harus disasarkan, kita dapat menyasarkan hampir semua bahan genetik yang mengandungi DNA. Sistem inilah yang digunakan sebagai asas penyuntingan gen/genom.

Sebenarnya konsep asal CRISPR ini telah ditemui sejak tahun 1987 oleh saintis di Jepun (Ishino et al., 1987). Mereka menjumpai satu urutan DNA yang berulang di dalam genom bakteria E. coli. Pada tahun-tahun berikutnya, para penyelidik telah menjumpai urutan DNA berulang yang sama pada pelbagai spesies bakteria dan arkea (Mojica et al., 2000). Namun, para penyelidik tidak jelas tentang fungsi sebenar urutan DNA berulang CRISPR ini sehinggalah pada tahun 2007, yang mana penyelidik makanan mengkaji bakteria jenis Streptococcus digunakan di dalam yogurt yang menggunakan CRISPR ini sebagai sistem imun adaptif (Barrangou et al., 2007).

Sekitar tahun 2011-2012, Jennifer Doudna dari University of California Berkeley dan Emmanuelle Charpentier dari Universiti Umeå di Sweden menemukan mekanisme fungsi sistem CRISPR/Cas9 (Deltcheva et al., 2011; Jinek et al., 2012). Mereka menunjukkan bahawa mereka dapat mengeksploitasikan protein Cas9 dengan memberikannya RNA tiruan sebagai panduan. Mereka mendapati bahawa enzim Cas9 ini akan mencari kod genetik yang sama dengan RNA panduan tersebut (bukan hanya pada virus) dan seterusnya mengikat dan memotong kod genetik tersebut. Dalam makalah yang diterbitkan tahun 2012, Doudna, Charpentier, dan Martin Jinek menunjukkan mereka mampu menggunakan sistem CRISPR/Cas9 ini untuk memotong genom di sebarang tempat yang mereka mahukan (Jinek et al., 2012). Lebih menarik, pada tahun 2013, kumpulan Feng Zhang di Broad Institute, Massachusetts Institute of Technology (MIT) menunjukkan bahawa sistem imun adaptif yang diguna pakai oleh bakteria ini boleh digunakan untuk mengedit genom dalam sel eukaryot termasuk sel manusia (Cong et al., 2013).

Sejak itu, para penyelidik mendapati bahawa CRISPR/Cas9 mempunyai aplikasi yang sangat luas (Rajah 2). Ia bukan sahaja dapat digunakan untuk menyahsesar gen, malah juga dapat membaik pulih atau menggantikan gen yang bermutasi dengan gen yang normal. Sebagai contoh, saintis dapat memanipulasi enzim Cas9 untuk menggantikan gen yang bertanggungjawab menyebabkan penyakit Huntington atau kanser dengan gen yang normal. Dalam contoh lain, penyelidik boleh menggunakan CRISPR untuk mengedit gen tanaman untuk mendapatkan hasil yang lebih produktif, berkhasiat atau mempunyai daya tahan yang tinggi terhadap tekanan persekitaran dan jangkitan perosak.

Rajah 1: Mekanisma pengeditan gen/genom oleh teknologi CRISPR-Cas9 Rajah 2. Aplikasi teknologi pengeditan gen/genom CRISPR-Cas

CAS13, pengeditan RNA, dan COVID-19

Rentetan daripada kejayaan untuk mengedit dan memanipulasi DNA dalam sel manusia dengan menggunakan teknologi CRISPR-Cas9, para saintis telah berusaha untuk mencari enzim atau protein baharu yang mempunyai fungsi seperti Cas9. Hasilnya beberapa protein Cas telah berjaya ditemui di dalam spesies bakteria, dan antara penemuan terpenting adalah penemuan protein Cas13 (Abudayyeh et al., 2016). Tidak seperti enzim Cas9 atau Cas12 yang bertindak ke atas DNA, Cas13 mensasarkan RNA sebagai substrat (Abudayyeh et al., 2017) (Cox et al., 2017). Namun begitu, mod penyasaran dan komponen yang diperlukan oleh sistem CRISPR-Cas13 ini untuk bertindak ke atas RNA adalah sama seperti CRISPR-Cas9. Penemuan Cas13 ini telah membuka satu lembaran baru, yang mana saintis kini mempunyai teknologi efektif untuk mengedit dan memanipulasi RNA bagi tujuan penyelidikan dan klinikal. Di samping itu, penemuan Cas13 juga telah mengubah landskap penyelidikan berkaitan virus kerana kebanyakan virus seperti Zika, Ebola, Influenza dan SARS-CoV-2 tidak mempunyai DNA dan kod genetik virus ini disimpan di dalam RNA. Oleh yang demikian penemuan dan pembangunan sistem CRISPR/Cas13 ini adalah satu kejayaan signifikan yang mencetuskan revolusi di dalam bidang ini, terutama sekali untuk tujuan pengesanan genom virus bagi menambah baik proses diagnostik dan juga penentuan terapi.

Rajah 3. Skematik komponen dan mod penyasaran RNA oleh CRIPSR-Cas13 dan panduan RNA

Terkini pada tahun 2017 majalah Science telah menerbitkan penemuan sistem pengesan penyakit yang dipanggil SHERLOCK (specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking) (Gootenberg et al., 2017). Ia merupakan sistem pengesan berkemampuan tinggi yang mengadaptasikan sistem CRISPR yang digunakan untuk mengesan banyak penyakit berjangkit merbahaya kepada manusia seperti Virus Influenza, Zika, Ebola, penyakit kanser, dan lain-lain. Ia juga berpotensi besar untuk membantu kita mengesan virus SARS-CoV-2 yang menyebabkan pandemik COVID-19. SHERLOCK mampu mengesan virus walaupun pada kepekatan yang sangat rendah iaitu sekitar 10 virus partikel per μL atau attomolar.

Cecair sampel seperti sampel air kencing, sedikit darah vena, air liur atau cecair badan yang lain akan diambil daripada pesakit. Jika sampel berkenaan mengandungi RNA virus SARS-CoV-2 (sebagai contoh), ia akan terlebih dahulu diperbanyak dengan menggunakan teknik reaksi berantai polimerase (polimerase chain reaction, PCR). Kemudian bahan pengesan yang mengandungi sebatian floresen pada seutas RNA, dan protein Cas13a (atau C2c2) akan dicampurkan. Cas13a ini merupakan enzim yang telah diubahsuai secara khusus dengan mengandungi RNA panduan yang digunakan khusus untuk mencari dan melekat pada bahagian tertentu gen protein S virus SARS-CoV-2. Reaksi ini akan menyebabkan Cas13a tersebut diaktifkan. Aktiviti Cas13a ini akan menyebabkan pemotongan apa-apa jenis RNA tanpa sasaran jujukan tertentu. Mengambil peluang atas aktiviti yang tidak spesifik ini, RNA yang mengandungi sebatian pelapor floresen (hanya aktif jika RNA terpotong) akan turut menjadi sasaran Cas13a dan signal akan dapat dibaca sejurus selepas molekul RNA tersebut terpotong. Dengan kata lain, ini merupakan satu teknologi umum (generic technology) yang mana dengan menggunakan sebatian pelapor yang sama, sistem ini boleh diaplikasikan untuk mengdiagnos semua penyakit yang mempunyai jujukan RNA/DNA yang khusus. Tambahan pula, ia dapat diaplikasikan di atas membran kertas sebagai teknologi in-situ atau pengesanan segera di tempat kejadian (point-of-care). Ia sangat berguna untuk kita mengdiagnos penyakit atau wabak di mana-mana sahaja terutamanya di tempat-tempat yang jauh dari capaian teknologi.

Rujukan

Abudayyeh, O.O., Gootenberg, J.S., Konermann, S., Joung, J., Slaymaker, I.M., Cox, D.B.T., Shmakov, S., Makarova, K.S., Semenova, E., Minakhin, L., et al. (2016). C2c2 is a single-component programmable RNA-guided RNA-targeting CRISPR effector. Science 353.

Abudayyeh, O.O., Gootenberg, J.S., Essletzbichler, P., Han, S., Joung, J., Belanto, J.J., Verdine, V., Cox, D.B.T., Kellner, M.J., Regev, A., et al. (2017). RNA targeting with CRISPR–Cas13. Nature 550, 280–284.

Adli, M. (2018). The CRISPR tool kit for genome editing and beyond. Nat. Commun. 9, 1911.

Barrangou, R., Fremaux, C., Deveau, H., Richards, M., Boyaval, P., Moineau, S., Romero, D.A., and Horvath, P. (2007). CRISPR Provides Acquired Resistance Against Viruses in Prokaryotes. Science 315, 1709–1712.

Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L.A., et al. (2013). Multiplex Genome Engineering Using CRISPR/Cas Systems. Science 339, 819–823.

Cox, D.B.T., Gootenberg, J.S., Abudayyeh, O.O., Franklin, B., Kellner, M.J., Joung, J., and Zhang, F. (2017). RNA editing with CRISPR-Cas13. Science 358, 1019–1027.

Deltcheva, E., Chylinski, K., Sharma, C.M., Gonzales, K., Chao, Y., Pirzada, Z.A., Eckert, M.R., Vogel, J., and Charpentier, E. (2011). CRISPR RNA maturation by trans -encoded small RNA and host factor RNase III. Nature 471, 602–607.

Gootenberg, J.S., Abudayyeh, O.O., Lee, J.W., Essletzbichler, P., Dy, A.J., Joung, J., Verdine, V., Donghia, N., Daringer, N.M., Freije, C.A., et al. (2017). Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science 356, 438–442.

Ishino, Y., Shinagawa, H., Makino, K., Amemura, M., and Nakata, A. (1987). Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product. J. Bacteriol. 169, 5429–5433.

Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J.A., and Charpentier, E. (2012). A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity. Science 337, 816–821.

Lander, E.S. (2016). The Heroes of CRISPR. Cell 164, 18–28.

Mojica, F.J.M., Díez‐Villaseñor, C., Soria, E., and Juez, G. (2000). Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea, Bacteria and mitochondria. Mol. Microbiol. 36, 244–246.

Kredit Foto : livescience

sumber asal : www.majalahsains.com

Write a Comment

view all comments

*